工作原理

1983年，WALZ公司首席科學(xué)家，德國(guó)烏茲堡大學(xué)教授Ulrich Schreiber博士利用調(diào)制技術(shù)和飽和脈沖技術(shù)，設(shè)計(jì)制造了全世界第一臺(tái)脈沖振幅調(diào)制（Pulse-Amplitude-Modulation，PAM）熒光儀——PAM-101/102/103。

所謂調(diào)制技術(shù)，就是說(shuō)用于激發(fā)熒光的測(cè)量光具有一定的調(diào)制（開(kāi)/關(guān)）頻率，檢測(cè)器只記錄與測(cè)量光同頻的熒光，因此調(diào)制熒光儀允許測(cè)量所有生理狀態(tài)下的熒光，包括背景光很強(qiáng)時(shí)。正是由于調(diào)制技術(shù)的出現(xiàn)，才使得葉綠素?zé)晒庥蓚鹘y(tǒng)的“黑匣子”（避免環(huán)境光）測(cè)量走向了野外環(huán)境光下測(cè)量，由生理學(xué)走向了生態(tài)學(xué)。

經(jīng)過(guò)充分暗適應(yīng)后，所有電子門均處于開(kāi)放態(tài)，打開(kāi)測(cè)量光得到Fo，此時(shí)給出一個(gè)飽和脈沖，所有的電子門就都將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了熒光和熱，此時(shí)得到的葉綠素?zé)晒鉃镕m。根據(jù)Fm和Fo可以計(jì)算出PS II的最大量子產(chǎn)量Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm，它反映了植物的潛在最大光合能力。

所謂飽和脈沖技術(shù)，就是打開(kāi)一個(gè)持續(xù)時(shí)間很短（一般小于1 s）的強(qiáng)光關(guān)閉所有的電子門（光合作用被暫時(shí)抑制），從而使葉綠素?zé)晒膺_(dá)到最大。飽和脈沖（Saturation Pulse, SP）可被看作是光化光的一個(gè)特例。光化光越強(qiáng)，PS II釋放的電子越多，PQ處累積的電子越多，也就是說(shuō)關(guān)閉態(tài)的電子門越多，F(xiàn)越高。當(dāng)光化光達(dá)到使所有的電子門都關(guān)閉（不能進(jìn)行光合作用）的強(qiáng)度時(shí)，就稱之為飽和脈沖。

打開(kāi)飽和脈沖時(shí)，本來(lái)處于開(kāi)放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素?zé)晒夂蜔幔現(xiàn)達(dá)到最大值。

在光照下光合作用進(jìn)行時(shí)，只有部分電子門處于開(kāi)放態(tài)。如果給出一個(gè)飽和脈沖，本來(lái)處于開(kāi)放態(tài)的電子門將該用于光合作用的能量轉(zhuǎn)化為了葉綠素?zé)晒夂蜔?，此時(shí)得到的葉綠素?zé)晒鉃镕m’。根據(jù)Fm’和F可以求出在當(dāng)前的光照狀態(tài)下PS II的實(shí)際量子產(chǎn)量Yield=ΦPSII=ΔF/Fm’=(Fm’-F)/Fm’，它反映了植物目前的實(shí)際光合效率。

光照狀態(tài)下打開(kāi)飽和脈沖時(shí)，電子門被完全關(guān)閉，光合作用被暫時(shí)抑制，也就是說(shuō)光化學(xué)淬滅被全部抑制，但此時(shí)熒光值還是比Fm低，也就是說(shuō)還存在熒光淬滅，這些剩余的熒光淬滅即為非光化學(xué)淬滅。淬滅系數(shù)的計(jì)算公式為：qP=(Fm’-Fs)/Fv’=1-(Fs-Fo’)/(Fm’-Fo’)；qN=(Fv-Fv’)/Fv=1-(Fm’-Fo’)/(Fm-Fo)；NPQ=(Fm-Fm’)/Fm’=Fm/Fm’-1。

在光照下光合作用進(jìn)行時(shí)，只有部分電子門處于關(guān)閉態(tài)，實(shí)時(shí)熒光F比Fm要低，也就是說(shuō)發(fā)生了熒光淬滅（quenching）。植物吸收的光能只有3條去路：光合作用、葉綠素?zé)晒夂蜔?。根?jù)能量守恒：1=光合作用+葉綠素?zé)晒?熱?？梢缘贸觯喝~綠素?zé)晒?1－光合作用－熱。也就是說(shuō)，葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量的下降（淬滅）有可能是由光合作用的增加或熱耗散的增加引起的。由光合作用的引起的熒光淬滅稱之為光化學(xué)淬滅（photochemical quenching, qP）；由熱耗散引起的熒光淬滅稱之為非光化學(xué)淬滅（non-photochemical quenching, qN或NPQ）。光化學(xué)淬滅反映了植物光合活性的高低；非光化學(xué)淬滅反映了植物耗散過(guò)剩光能為熱的能力，也就是光保護(hù)能力。

根據(jù)PS II的實(shí)際量子產(chǎn)量ΔF/Fm’和光合有效輻射（Photosynthetically Active Radiation, PAR）還可計(jì)算出光合電子傳遞的相對(duì)速率rETR=ΔF/Fm’·PAR·0.84·0.5。其中0.84是植物的經(jīng)驗(yàn)性吸光系數(shù)，0.5是假設(shè)植物吸收的光能被兩個(gè)光系統(tǒng)均分。

當(dāng)F達(dá)到穩(wěn)態(tài)后關(guān)閉光化光，同時(shí)打開(kāi)遠(yuǎn)紅光（Far-red Light, FL）（約持續(xù)3－5 s），促進(jìn)PS I迅速吸收累積在電子門處的電子，使電子門在很短的時(shí)間內(nèi)回到開(kāi)放態(tài)，F(xiàn)回到最小熒光Fo附近，此時(shí)得到的熒光為Fo’。由于在野外測(cè)量Fo’不方便，因此野外版的調(diào)制熒光儀（除PAM-2100和WATER-PAM）外，多數(shù)不配置遠(yuǎn)紅光。此時(shí)可以直接利用Fo代替Fo’來(lái)計(jì)算qP和qN，盡管得到的參數(shù)值有輕微差異，但qP和qN的變化趨勢(shì)與利用Fo’計(jì)算時(shí)是一致的。由于NPQ的計(jì)算不需Fo’，近10幾年來(lái)得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

2常用型號(hào)

葉綠素 - 分類

葉綠素分為葉綠素a、葉綠素b、葉綠素c、葉綠素d、原葉綠素和細(xì)菌葉綠素等。

葉綠素名稱存在場(chǎng)所最大吸收光帶

葉綠素a所有綠色植物中紅光和藍(lán)紫光

葉綠素b高等植物、綠藻、眼蟲(chóng)藻、管藻紅光和藍(lán)紫光

葉綠素c硅藻、甲藻、褐藻紅光和藍(lán)紫光

葉綠素d紅藻紅光和藍(lán)紫光

原葉綠素黃化植物（幼苗期）近于紅光和藍(lán)紫光

細(xì)菌葉綠素紫色細(xì)菌紅光和藍(lán)紫光

葉綠素 - 化學(xué)結(jié)構(gòu)

葉綠素分子結(jié)構(gòu)

19世紀(jì)初，俄國(guó)化學(xué)家、色層分析法創(chuàng)始人M.C.茨韋特用吸附色層分析法證明高等植物葉子中的葉綠素有兩種成分。德國(guó)H.菲舍爾等經(jīng)過(guò)多年的努力，弄清了葉綠素的復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)。1960年美國(guó)R.B.伍德沃德領(lǐng)導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)室合成了葉綠素a。至此,葉綠素的分子結(jié)構(gòu)得到定論。

葉綠素分子是由兩部分組成的：核心部分是一個(gè)卟啉環(huán)(porphyrin ring)，其功能是光吸收；另一部分是一個(gè)很長(zhǎng)的脂肪烴側(cè)鏈，稱為葉綠醇(phytol)，葉綠素用這種側(cè)鏈插入到類囊體膜。與含鐵的血紅素基團(tuán)不同的是，葉綠素卟啉環(huán)中含有一個(gè)鎂原子。葉綠素分子通過(guò)卟啉環(huán)中單鍵和雙鍵的改變來(lái)吸收可見(jiàn)光。各種葉綠素之間的結(jié)構(gòu)差別很小。如葉綠素a和b僅在吡咯環(huán)Ⅱ上的附加基團(tuán)上有差異：前者是甲基，后者是甲醛基。細(xì)菌葉綠素和葉綠素a不同處也只在于卟啉環(huán)Ⅰ上的乙烯基換成酮基和環(huán)Ⅱ上的一對(duì)雙鍵被氫化。

葉綠素 - 化學(xué)性質(zhì)

高等植物葉綠體中的葉綠素主要有葉綠素a 和葉綠素b 兩種。它們不溶于水，而溶于有機(jī)溶劑，如乙醇、丙酮、乙醚、氯仿等。葉綠素a分子式：C55H72O5N4Mg；葉綠素b分子式：C55H70O6N4Mg。在顏色上，葉綠素a 呈藍(lán)綠色，而葉綠素b 呈黃綠色。按化學(xué)性質(zhì)來(lái)說(shuō)，葉綠素是葉綠酸的酯，能發(fā)生皂化反應(yīng)。葉綠酸是雙羧酸，其中一個(gè)羧基被甲醇所酯化，另一個(gè)被葉醇所酯化。

葉綠素分子含有一個(gè)卟啉環(huán)的“頭部”和一個(gè)葉綠醇的“尾巴”。鎂原子居于卟啉環(huán)的中央，偏向于帶正電荷，與其相聯(lián)的氮原子則偏向于帶負(fù)電荷，因而卟啉具有極性，是親水的，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合。葉醇是由四個(gè)異戊二烯單位組成的雙萜，是一個(gè)親脂的脂肪鏈，它決定了葉綠素的脂溶性。葉綠素不參與氫的傳遞或氫的氧化還原，而僅以電子傳遞（即電子得失引起的氧化還原）及共軛傳遞（直接能量傳遞）的方式參與能量的傳遞。

卟啉環(huán)中的鎂原子可被氫離子、銅離子、鋅離子所置換。用酸處理葉片，氫離子易進(jìn)入葉綠體，置換鎂原子形成去鎂葉綠素，使葉片呈褐色。去鎂葉綠素易再與銅離子結(jié)合，形成銅代葉綠素，顏色比原來(lái)更穩(wěn)定。人們常根據(jù)這一原理用醋酸銅處理來(lái)保存綠色植物標(biāo)本。 葉綠醇是親脂的脂肪族鏈，由于它的存在而決定了葉綠素分子的脂溶性，使之溶于丙酮、酒精、乙醚等有機(jī)溶劑中。由于在結(jié)構(gòu)上的差別，葉綠素a呈藍(lán)綠色，b呈黃綠色。在光下易被氧化而退色。葉綠素是雙羧酸的酯，與堿發(fā)生皂化反應(yīng)。

葉綠素不很穩(wěn)定，光、酸、堿、氧、氧化劑等都會(huì)使其分解。酸性條件下，葉綠素分子很容易失去卟啉環(huán)中的鎂成為去鎂葉綠素。葉綠素溶液能進(jìn)行部分類似光合作用的反應(yīng)，在光下使某些化合物氧化或還原。人工制備的葉綠素膜在光下能產(chǎn)生光電位和光電流，也能催化某些氧化還原反應(yīng)。

葉綠素 - 光和作用

光和作用

光合作用是指綠色植物通過(guò)葉綠體，利用光能，把二氧化碳和水轉(zhuǎn)化成儲(chǔ)存著能量的有機(jī)物，并且釋放出氧的過(guò)程。光合作用的第一步是光能被葉綠素吸收并將葉綠素離子化。產(chǎn)生的化學(xué)能被暫時(shí)儲(chǔ)存在三磷酸腺苷(ATP)中，并最終將二氧化碳和水轉(zhuǎn)化為碳水化合物和氧氣。

1864年，德國(guó)科學(xué)家薩克斯做了這樣一個(gè)實(shí)驗(yàn)：把綠色葉片放在暗處幾小時(shí)，目的是讓葉片中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗掉。然后把這個(gè)葉片一半曝光，另一半遮光。過(guò)一段時(shí)間后，用碘蒸氣處理葉片，發(fā)現(xiàn)遮光的那一半葉片沒(méi)有發(fā)生顏色變化，曝光的那一半葉片則呈深藍(lán)色。這一實(shí)驗(yàn)成功地證明了綠色葉片在光合作用中產(chǎn)生了淀粉。

1880年，德國(guó)科學(xué)家恩吉爾曼用水綿進(jìn)行了光合作用的實(shí)驗(yàn)：把載有水綿和好氧細(xì)菌的臨時(shí)裝片放在沒(méi)有空氣并且是黑暗的環(huán)境里，然后用極細(xì)的光束照射水綿。通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，好氧細(xì)菌只集中在葉綠體被光束照射到的部位附近；如果上述臨時(shí)裝片完全暴露在光下，好氧細(xì)菌則集中在葉綠體所有受光部位的周圍。恩吉爾曼的實(shí)驗(yàn)證明：氧是由葉綠體釋放出來(lái)的，葉綠體是綠色植物進(jìn)行光合作用的場(chǎng)所?！?/p>

將一片脫去淀粉的紫羅蘭葉片放在陽(yáng)光下數(shù)小時(shí)之后用碘試劑檢測(cè)，可以發(fā)現(xiàn)只有葉片上綠色的區(qū)域變色而白色區(qū)域沒(méi)有，也就是說(shuō)只有綠色區(qū)域有淀粉存在。這顯示了光合作用在缺乏葉綠素的情況下無(wú)法進(jìn)行，葉綠素存在是光合作用的必要條件。

葉綠素 - 熒光現(xiàn)象和磷光現(xiàn)象

葉綠素?zé)晒鈨x

葉綠素的可見(jiàn)光波段的吸收光譜，在藍(lán)光和紅光處各有一顯著的吸收峰。吸收峰的位置和消光值的大小隨葉綠素種類不同而有所不同。葉綠素a最大的吸收光的波長(zhǎng)在420-663nm，葉綠素b 的最大吸收波長(zhǎng)范圍在460-645nm。當(dāng)葉綠素分子位于葉綠體膜上時(shí)，由于葉綠素與膜蛋白的相互作用，會(huì)使光吸收的特性稍有改變。

葉綠素的酒精溶液在透射光下為翠綠色，而在反射光下為棕紅色。這個(gè)紅光就是葉綠素受光激發(fā)后發(fā)射的熒光。這個(gè)現(xiàn)象就是熒光現(xiàn)象。其主要原理是由于葉綠素有兩個(gè)不同的吸收峰。葉綠素吸收光的能力極強(qiáng)，如果把葉綠素的丙酮提取液放在光源與分光鏡之間，可以看到光譜中有些波長(zhǎng)的光被吸收了。因此，在光譜上就出現(xiàn)了黑線或暗帶，這種光譜叫吸收光譜。葉綠素吸收光譜的最強(qiáng)區(qū)域有兩個(gè)：一個(gè)是在波長(zhǎng)為640nm-660nm的紅光部分，另一個(gè)在波長(zhǎng)為430nm-450nm的藍(lán)紫光部分。對(duì)其他光吸收較少，其中對(duì)綠光吸收最少，由于葉綠素吸收綠光最少，所以葉綠素的溶液呈綠色。葉綠素的丙酮提取液在透射光下是翠綠色的，而在反射光下是綜紅色的。 葉綠素溶液的熒光可達(dá)吸收光的10%左右。而鮮葉的熒光程度較低，指占其吸收光的0.1%-1%左右。

熒光效應(yīng)在植物生理學(xué)中有廣泛的應(yīng)用。用這個(gè)效應(yīng)可以研究植物的抗逆生理。因?yàn)樵谀婢诚?，植物的葉綠素會(huì)發(fā)生變換，研究其熒光，可以作為植物受逆境脅迫程度的指標(biāo)。另外，還有一個(gè)磷光效應(yīng)。就是當(dāng)熒光出現(xiàn)后，立即中斷光源，用靈敏的光學(xué)儀器還可在短時(shí)間內(nèi)看到微弱紅光，這就是磷光。

葉綠素 - 生物合成與代謝

葉綠素a的生物合成途徑，是由琥珀酰輔酶A和甘氨酸縮合成δ-氨基乙酰丙酸，兩個(gè)δ-氨基乙酰丙酸縮合成吡咯衍生物膽色素原，然后再由4個(gè)膽色素原聚合成一個(gè)卟啉環(huán)──原卟啉Ⅳ，原卟啉Ⅳ是形成葉綠素和亞鐵血紅素的共同前體，與亞鐵結(jié)合就成亞鐵血紅素，與鎂結(jié)合就成鎂原卟啉。鎂原卟啉再接受一個(gè)甲基，經(jīng)環(huán)化后成為具有第Ⅴ環(huán)的原脫植醇基葉綠素，后者經(jīng)光還原、酯化等步驟而形成葉綠素a。

落葉

葉綠素在活體內(nèi)也和其他物質(zhì)一樣處于不斷更新?tīng)顟B(tài)。它被葉綠素酶分解，或經(jīng)光氧化而漂白。深秋時(shí)許多樹(shù)種葉片呈美麗的紅色，就是因?yàn)檫@時(shí)葉綠素降解速度大于合成速度，含量下降，原來(lái)被葉綠素所掩蓋的類胡蘿卜素、花色素的顏色顯示出來(lái)的緣故。

在植物衰老和儲(chǔ)藏過(guò)程中，酶能引起葉綠素的分解破壞。這種酶促變化可分為直接作用和間接作用兩類。直接以葉綠素為底物的只有葉綠素酶，催化葉綠素中植醇酯鍵水解而產(chǎn)生脫植醇葉綠素。脫鎂葉綠素也是它的底物，產(chǎn)物是水溶性的脫鎂脫植葉綠素，它是橄欖綠色的。葉綠素酶的最適溫度為60-82℃，100℃時(shí)完全失活。起間接作用的有蛋白酶、酯酶、脂氧合酶、過(guò)氧化物酶、果膠酯酶等。蛋白酶和酯酶通過(guò)分解葉綠素蛋白質(zhì)復(fù)合體，使葉綠素失去保護(hù)而更易遭到破壞。脂氧合酶和過(guò)氧化物酶可催化相應(yīng)的底物氧化，其間產(chǎn)生的物質(zhì)會(huì)引起葉綠素的氧化分解。果膠酯酶的作用是將果膠水解為果膠酸，從而提高了質(zhì)子濃度，使葉綠素脫鎂而被破壞。

在活體綠色植物中，葉綠素既可發(fā)揮光合作用，又不會(huì)發(fā)生光分解。但在加工儲(chǔ)藏過(guò)程中，葉綠素經(jīng)常會(huì)受到光和氧氣作用，被光解為一系列小分子物質(zhì)而褪色。光解產(chǎn)物是乳酸、檸檬酸、琥珀酸、馬來(lái)酸以及少量丙氨酸。因此，正確選擇包裝材料和方法以及適當(dāng)使用抗氧化劑，以防止光氧化褪色。

葉綠素 - 提取

綠葉

葉綠素提取的準(zhǔn)備工作是在一個(gè)半暗的房間里，室溫保持在25℃。提取步驟如下：

(1) 取1000克新鮮的綠葉，在韋氏攪切器中粉碎。

(2)將粉碎的1000克綠葉放進(jìn)加有少量的碳酸鈣的丙酮中(溫度20℃)進(jìn)行萃取，直到過(guò)濾、清洗后的葉子碎片為無(wú)色。

(3)將過(guò)濾后的丙酮提取液放到盛有1升石油醚和100ml丙酮的漏斗中，然后輕輕地旋轉(zhuǎn)，同時(shí)加放蒸餾水直到分層為止。水層的大部分丙酮和水溶雜質(zhì)被丟棄，只剩石油醚溶液。

(4)將石油醚溶液用蒸餾水再次凈化后，用含有石油醚和0.01克草酸的200ml80%的甲醇溶液清洗5次以上，最后得到黃綠色懸浮液。

(5)用無(wú)水硫酸鈉對(duì)懸浮液進(jìn)行干燥，并將其滲入到3cm厚的蔗糖粉末制成柱中，然后用石油醚清洗沉淀的色素去掉類胡蘿卜素，使之只含有天然的葉綠素。

(6)含有天然葉綠素的蔗糖柱分兩層，綠層有4-10mm的葉綠素b層，另一藍(lán)層為2-6mm的葉綠素a層。

(7)將位于藍(lán)層正中的部分(約占藍(lán)層的一半) 放入醚中，對(duì)此懸浮液進(jìn)行過(guò)濾、洗提，用蒸餾水清洗，用硫酸鈉干燥，再用器皿進(jìn)行過(guò)濾后，得到葉綠素a。

(8)將(6)中的綠層中間部分移出，迅速放入醚中過(guò)濾、洗提，制成葉綠素b醚溶液。

葉綠素 - 用途

葉綠素產(chǎn)品

造血功能

諾貝爾得獎(jiǎng)人Dr.Richard Willstatter和Dr.Hans Fisher發(fā)現(xiàn)：葉綠素的分子與人體的紅血球分子在結(jié)構(gòu)上很是相似，唯一的分別就是各自的核心為鎂原子與鐵原子。因此，飲用葉綠素對(duì)產(chǎn)婦與因意外失血者會(huì)有很大的幫助。

幫助解除體內(nèi)殺蟲(chóng)劑與藥物殘?jiān)?/p>

營(yíng)養(yǎng)學(xué)家Bernard Jensen博士指出，葉綠素能除去殺蟲(chóng)劑與藥物殘?jiān)亩舅?，并能與輻射性物質(zhì)結(jié)合而將之排出體外。此外，他也發(fā)現(xiàn)一般上健康的人會(huì)比病患者擁有較高的血球計(jì)數(shù)，但通過(guò)吸收大量的葉綠素之后，病患者的血球計(jì)數(shù)就會(huì)增加，健康狀況也會(huì)有所改善。

養(yǎng)顏美膚

新英國(guó)醫(yī)藥期刊曾經(jīng)做過(guò)這樣的報(bào)導(dǎo)：葉綠素有助于克制內(nèi)部感染與皮膚問(wèn)題。美國(guó)外科雜志報(bào)導(dǎo)：Temple大學(xué)在1200名病人身上，嘗試以葉綠素醫(yī)治各種病癥，效果極佳。

葉綠素 - 新聞動(dòng)態(tài)

澳研究人員偶然提取到新型葉綠素

澳大利亞悉尼大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院研究人員宣布，他們發(fā)現(xiàn)了一種新葉綠素，它在生物能源領(lǐng)域可望擁有廣闊的應(yīng)用前景。