流式細胞儀的工作原理

1）參數(shù)測量原理：流式細胞計可同時進行多參數(shù)測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區(qū)進行的，所謂測量區(qū)就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區(qū)時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態(tài)、質(zhì)膜和細胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因為這些生物學(xué)參數(shù)又和細胞對光線的反射、折射等光學(xué)特性有關(guān)。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特征性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經(jīng)染色活細胞進行分析和分選。經(jīng)過固定的和染色處理的細胞由于光學(xué)性質(zhì)的改變，其散射光信號當(dāng)然不同于活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數(shù)相關(guān)，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關(guān)。

　　在流式細胞術(shù)測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0。角）散射（FSC）；②側(cè)向散射（SSC），又稱90。角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關(guān)，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經(jīng)實驗表明在小立體角范圍內(nèi)基本上和截面積大小成線性關(guān)系；對于形狀復(fù)雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側(cè)向散射光的測量主要用來獲取有關(guān)細胞內(nèi)部精細結(jié)構(gòu)的顆粒性質(zhì)的有關(guān)信息。側(cè)向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關(guān)，但它對細胞膜、胞質(zhì)、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質(zhì)內(nèi)較大顆粒給出靈敏反映。

　　在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當(dāng)光散射分析與熒光探針聯(lián)合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。

　　熒光信號主要包括兩部分：①自發(fā)熒光，即不經(jīng)熒光染色細胞內(nèi)部的熒光分子經(jīng)光照射后所發(fā)出的熒光；②特征熒光，即由細胞經(jīng)染色結(jié)合上的熒光染料受光照而發(fā)出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發(fā)熒光信號為噪聲信號，在多數(shù)情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學(xué)等測量中，對于結(jié)合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關(guān)鍵。一般說來，細胞成分中能夠產(chǎn)生的自發(fā)熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發(fā)熒光越強；培養(yǎng)細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發(fā)熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發(fā)熒光越強。

　　減少自發(fā)熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學(xué)系統(tǒng)；③采用電子補償電路，將自發(fā)熒光的本底貢獻予以補償。

　　（2）樣品分選原理：流式細胞計的分選功能是由細胞分選器來完成的。總的過程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據(jù)選定的某個參數(shù)由邏輯電路判明是否將被分選，而后由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發(fā)生偏轉(zhuǎn)，落入收集器中；其它液體被當(dāng)作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有采用捕獲管來進行分選的。

　　穩(wěn)定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發(fā)生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數(shù)百μm。實驗經(jīng)驗公式f=v/4.5d給出形成穩(wěn)定水滴的振蕩信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉(zhuǎn)是由充電電路和偏轉(zhuǎn)板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉(zhuǎn)板間的電位差為數(shù)千伏。充電電路中的充電脈沖發(fā)生器是由邏輯電路控制的，因此從參數(shù)測定經(jīng)邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，一般為數(shù)十ms。精確測定延遲時間是決定分選質(zhì)量的關(guān)鍵，儀器多采用移位寄存器數(shù)字電路來產(chǎn)生延遲。可根據(jù)具體要求予以適當(dāng)調(diào)整。

　　（3）數(shù)據(jù)處理原理：FCM的數(shù)據(jù)處理主要包括數(shù)據(jù)的顯示和分析，至于對儀器給出的結(jié)果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。

　　①數(shù)據(jù)顯示：FCM的數(shù)據(jù)顯示方式包括單參數(shù)直方圖（histogram）、二維點圖（dot plot）、二維等高圖（contour ）、假三維圖（pseudo 3D）和列表模式（list mode）等。
　　直方圖是一維數(shù)據(jù)用昨最多的圖形顯示形式，既可用于定性分析，又可用于定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據(jù)選擇放大器類型不同，橫座標可以是線性標度或?qū)��?shù)標度，用“道數(shù)”（Channel No .）來表示,實質(zhì)上是所測的熒光或散射光的強度�？v座標一般表示的是細胞的相對數(shù)。
　　二維點圖能夠顯示兩個獨立參數(shù)與細胞相對數(shù)之間的關(guān)系。橫座標和縱座標分別為與細胞有關(guān)的兩個獨立參數(shù)，平面上每一個點表示同時具有相應(yīng)座標植的細胞存在（圖10-3）�？梢杂啥�維點圖得到兩個一維直方圖，但是由于兼并現(xiàn)象存在，二維點圖的信息量要大于二個一維直方圖的信息量。所謂兼并就是說多個細胞具有相同的二維座標在圖上只表現(xiàn)為一個點，這樣對細胞點密集的地方就難于顯示它的精細結(jié)構(gòu)。
　　二維等高圖類似于地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點圖的不足而設(shè)置的顯示方法。等高圖上每一條連續(xù)曲線上具有相同的細胞相對或絕對數(shù)，即“等高”。曲線層次越高所代表的細胞數(shù)愈多。一般層次所表示的細胞數(shù)間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。
　　假三維圖是利用計算機技術(shù)對二維等高圖的一種視覺直觀的表現(xiàn)方法。它把原二維圖中的隱座標—細胞數(shù)同時顯現(xiàn)，但參數(shù)維圖可以通過旋轉(zhuǎn)、傾斜等操作，以便多方位的觀察“山峰”和“谷地”的結(jié)構(gòu)和細節(jié)　，這無疑是有助于對數(shù)據(jù)進行分析的。
　�、跀�(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析的方法總的可分為參數(shù)方法和非參數(shù)方法兩大類。當(dāng)被檢測的生物學(xué)系統(tǒng)能夠用某種數(shù)學(xué)模型技術(shù)時則多使用參數(shù)方法。數(shù)學(xué)模型可以是一個方程或方程組，方程的參數(shù)產(chǎn)生所需要的信息來自所測的數(shù)據(jù)。例如在測定老鼠精子的DNA含量時，可以獲取細胞頻數(shù)的尖銳波形分布。如果采用正態(tài)分布函數(shù)來描述這些數(shù)據(jù)，則參數(shù)即為面積、平均值和標準偏差。方程的數(shù)據(jù)擬合則通常使用最小二乘法。而非參數(shù)分析法對測量得到的分布形狀不需要做任何假設(shè)，即采用無設(shè)定參數(shù)分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數(shù)分布；也可能很復(fù)雜，要對兩個或多個直方圖逐道地進行比較。

　　逐點描圖（或用手工，或用描圖儀、計算機系統(tǒng)）是大家常用的數(shù)據(jù)分析的重要手段。我們常可以用來了解數(shù)據(jù)的特性、尋找那些不曾預(yù)料的特異征兆、選擇統(tǒng)計分析的模型、顯示最終結(jié)果等。事實上，不經(jīng)過先對數(shù)據(jù)進行直觀觀察分析就決不應(yīng)該對這批數(shù)據(jù)進行數(shù)值分析。從這一點來看，非參數(shù)分析是參數(shù)分析的基礎(chǔ)。

　　逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發(fā)現(xiàn)明顯的差異，特別是對照組和測試組�？紤]到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組、陰性對照組、或零時刻對照組等，具體設(shè)置應(yīng)根據(jù)整體實驗要求而定。對照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進行比較時對曲線的總細胞數(shù)進行歸一化處理，甚至對兩條曲線逐道相減而得到“差結(jié)果曲線”往往是適宜的。